豬胚胎干細胞分離培養(yǎng)自我更新和分化潛能,，利用不同培養(yǎng)條件，從孤雌胚胎,、細胞核移植胚胎和體內(nèi)受精胚胎中分離樣細胞,。MVE液氮罐

1.細胞培養(yǎng)用于核移植供體的豬胎兒成纖維細胞

從初生豬仔的耳部分離得到。細胞培養(yǎng)基為DMEM,，15%胎牛血清,，培養(yǎng)溫度為37℃，5%CO2,。細胞凍存,，使用0.25%(W/V)的胰蛋白酶消化，中和后離心200Xg，5min,。將細胞重懸后并加入等量凍存液(40%DMEM,，40%FBS和20%DMSO)，貯存在液氮罐中,。

2.卵母細胞的收集和準備

從屠宰場收集豬卵巢，保存在含有青/鏈霉素的生理鹽水中,，運輸溫度32~38℃,，3h內(nèi)運回實驗室。采用抽吸法采集卵巢卵母細胞,。抽取3~6mm卵泡中的卵母細胞置于15mL離心管中,，37℃水浴靜置數(shù)分鐘，待卵母細胞沉降后,，用洗卵液洗2遍,，顯微鏡下挑取顆粒細胞層達3層以上的卵丘卵母細胞復(fù)合物(cumulusoocytecomplex，COCs),，然后將COCs轉(zhuǎn)入U型皿中培養(yǎng)42~44h,，每孔加500μL成熟培養(yǎng)液，每孔放置50~70枚,。

3.孤雌激活和胚胎培養(yǎng)

用電融合儀將成熟的卵母細胞進行電激活,，漂洗后，將卵母細胞移至2mmol/L6D孵育2.5h,。分別將卵母細胞轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)基G1,、NCSU23和豬受精卵培養(yǎng)基，24h后記錄卵裂率,。3d后,，將培養(yǎng)基G1中發(fā)育的胚胎移入囊胚培養(yǎng)基G2。再次培養(yǎng)3~4d后,，統(tǒng)計囊胚個數(shù)并收集,。

4.體細胞核移植胚胎培養(yǎng)

去除成熟卵母細胞第一極體，隨后注入供體細胞,。顯微操作后,，移入含10%FBS的M199培養(yǎng)基，在38.5℃,，5%CO2條件下孵育0.5h,，使用電融合儀進行激活處理，移入6D孵育2.5h后,，將重組胚胎在NCSU23培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d,，隨后替換NC-SU23繼續(xù)培養(yǎng)3~5d，觀察胚胎的發(fā)育,。

5.體內(nèi)胚胎的收集

從人工受精的母豬體內(nèi)收集第7~8d的囊胚,，所有方法參照Stokes等(2005),。每天監(jiān)測母豬的發(fā)情，將發(fā)情日期作為0d,，鑒定發(fā)情后的6,、12和18h進行人工受精。從子宮沖洗胚胎時使用預(yù)熱的含10%FBS的磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersa-line,，PBS),。

6.從豬胚胎分離胚胎多能干細胞

將去除透明帶的囊胚接種到絲裂霉素C(mi-tomycin-C)處理過的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonicfibroblastcells，MEFs)飼養(yǎng)層上2~4d,，囊胚內(nèi)細胞團(innercellmass,，ICM)在3~5d后出現(xiàn)。待ICM大小適中時,，用機械法分離細胞,，重鋪到新的飼養(yǎng)層上，并使用不同的豬胚胎干細胞(por-cineembryonicstemcells,，pESCs)培養(yǎng)基(ESM1~ESM6,，表1)，胚胎多能干細胞克隆每5~7d使用機械法傳代,。

7.免疫熒光檢測

使用4%多聚甲醛固定胚胎10min,，PBS洗2次后，加入0.25%Triton-X室溫30min,，PBS洗3次,，1%BSA室溫封閉1h，4℃孵育一抗24h(1∶200,，CDX2;1∶200NANOG),。PBS沖洗3次，孵育熒光標記的二抗(1∶1000)室溫1h,。PBS沖洗2次后,，DAPI染色2min，PBS沖洗2次后在熒光顯微鏡下觀察照相,。

8.qRT-PCR

使用0.5%鏈霉蛋白酶A去除豬胚胎的透明帶后,，立刻加入5μL的裂解緩沖液(5mmol/L二硫蘇糖醇，1%NP-40,，1U/uLRNA酶抑制劑),，冰上孵育30min。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將裂解液反轉(zhuǎn)錄為cDNA,。qRT-PCR體系：cDNA2μL,，SYBRgreenmix12.5μL，上下游引物各0.3μmol/L0.5μL，ddH2O補充到25μL,。反應(yīng)程序：95℃30s;95℃5s,，60℃30s，共40個循環(huán),。MVE液氮罐